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    深圳市汉科生物工程有限公司在2014年年底正式将CAR-T与CAR-NK列入研发课题,并于2014年12月正式启动CAR-T与CAR-NK课题项目

    作者:admin 发表时间:2015/2/1 阅读:1619 次

    CAR-T细胞治疗技术

    CAR-T细胞治疗技术即嵌合抗原受体T细胞治疗技术,通过基因工程的方法,在体外将能够识别肿瘤细胞表面特异性抗原的免疫球蛋白样受体scFv和细胞内活化基序构建在一起,再利用病毒等载体转染T细胞,使其不受MHC限制的活化并识别杀灭肿瘤细胞。最早于1989年由宾夕法尼亚的科学家提出,近年才被批准应用于临床,并在肿瘤治疗方面表现出了前所未有的疗效。多家医药巨头纷纷跟进,其中最具代表性的是诺华公司的LT019。CLT019在一个复发性/无应答B细胞急性白血病的临床实验中达到近90%的完全应答率。采用CLT019治疗六个月的无进展生存率67%,最长的应答达到两年。从而被誉为是抗癌研究的颠覆性突破,最有可能治愈癌症的手段之一。目前CAR-T细胞技术发展速度非常之快,但仍然存在T细胞体内存活时间短,CARs表达稳定性差、胞内活化区信号转导功能不足、转染方式安全性、临床表现出“细胞因子风暴”等副作用、潜在脱靶风险、肿瘤特异性靶点缺乏等亟待解决问题,因此该技术的研发方向主要瞄准开发新的T细胞活化基序和协同刺激分子,研究发现新的肿瘤特异性靶位,提升转染工具的安全性,临床研究制订详细的不同肿瘤T细胞治疗方案等,以求在提高治疗效果的同时,能够极大的降低治疗风险。

        CAR-T细胞治疗的技术路线大致分为两条路径:1、确定肿瘤特异性靶点——获得并合成免疫球蛋白样受体——体外构建scFV和活化基序的融合基因——体外构建病毒转染载体——转染细胞获得病毒颗粒;2、患者筛查——获取患者新鲜血液50-100ml——分离提取患者PBMC——诱导扩增患者T细胞亚群;最后将制备的患者T细胞和病毒颗粒进行共培养获得能够识别肿瘤表面抗原的CAR-T细胞,应用于临床治疗。

        我国是世界范围内癌症人数发病率和死亡率的第一大国,每年新生肿瘤患者达300多万人,抗癌形势异常严峻;传统手术和放化疗局限性大,已经不能满足新的肿瘤治疗需求,亟需自主开发新的癌症治疗手段。CAR-T细胞治疗技术是免疫细胞治疗的最新发展方向,本公司计划自主研发的CAR-T细胞治疗技术是以欧美主流的第三代CAR-T为基础,以造福国内肿瘤患者为宗旨,以开发新的CAR-T肿瘤靶标和提升安全性为目标的肿瘤治疗前沿技术。项目的稳步实施可以大大推动国内CAR-T细胞治疗技术的研发进度,有望通过开发出新的肿瘤特异性靶位和信号活化基序,有效降低国内相关肿瘤治疗的费用和死亡率,为提升国内免疫细胞治疗的整体水平做出贡献。

        CAR-NK细胞治疗技术

    人体免疫系统可以对癌细胞表达的特异性蛋白做出应答,而这种免疫应答能够被用于癌症治疗。过继免疫治疗就是把致敏的淋巴细胞输送给肿瘤病人,使其获得抗肿瘤的免疫力而对肿瘤进行的生物疗法。近年来,嵌合抗原受体(CAR)T细胞是发展非常迅速的一种细胞治疗技术,通过基因改造技术, 效应T细胞的靶向性、杀伤活性和持久性均较常规应用的免疫细胞高, 并可克服肿瘤局部免疫抑制微环境和打破宿主免疫耐受状态,逐渐成熟为一种治疗肿瘤的新策略。NK细胞也是机体重要的免疫细胞,同时具有广谱的抗肿瘤细胞作用,即不依赖于抗原激活的作用,就可非特异性的杀伤肿瘤细胞,因此,NK细胞对肿瘤的过继免疫治疗也具有非常良好的应用前景。在此基础上,将嵌合抗原受体技术与NK细胞的过继免疫治疗方法结合起来而形成的嵌合抗原受体NK(CAR-NK)细胞肿瘤疗法逐步成为我公司开发新一代产品的方向。

    本公司启动的项目研究内容就是在NK细胞体外扩增平台的基础上,将嵌合抗原受体的靶点序列构建在表达载体中,表达于NK细胞表面,形成CAR-NK细胞,为后续的肿瘤国际免疫治疗提供技术基础。具体的实验流程如下:

    1 载体的构建

    目前,大多数嵌合抗原受体由胞外结合区、铰链区、跨膜区和信号内区域组成,结构域CAR能与靶抗原高亲和性结合而不受中枢耐受的影响,以不依赖MHC的方式识别肿瘤表面的靶抗原。最初的CAR是将免疫球蛋白样scFv和FcεRI受体(γ链)或者CD3复合物(ζ链)胞内结构域融合形成嵌合受体,本项目将会采用第三代CAR,即在嵌合受体上加上4-1BBL等的共刺激结构域,能够导致淋巴细胞效应活性进一步增加,存活时间增强。

    将上述结构域基因序列获取后,克隆进慢病毒载体,通过感染细胞以实现稳定导入和表达基因。

    2 NK细胞的获取

    由于NK细胞只占人外周血淋巴细胞(PBMC)的10%左右,单纯分离而来的NK细胞远无法满足肿瘤治疗,因此需要对分离出的PBMC进行体外扩增,在培养基中加入IL-2,并在培养体系中加入刺激细胞,以及获得高纯度、大数量的NK细胞。

    3 抗体的表达

    由于淋巴细胞的基因操作较为困难,普通质粒难以转入,因此需要通过病毒感染的方式将构建的基因表达与NK细胞。

    项目将会采用病毒作为主要转染载体,把携带目的基因的载体与其他两种参与合成病毒的载体用脂质体一同转染入293T细胞,使其在胞内合成病毒,之后提取培养上清中包装好的病毒颗粒感染NK细胞,将目的基因带入NK细胞,使嵌合抗原受体表达于细胞的表面,获得CAR-NK细胞,继而应用于临床治疗特异性肿瘤。



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